Stap 6: Assay instellen
Voorbereiding van de normen door aliquoting de laagste concentratie van DNA eerst; om verontreiniging te voorkomen. Beginnen met standaard 11 en sluit vervolgens het GLB.
1 25ul 2.0ng /ul standaard + 75ul 1 X TE
2 20ul 2.0ng / ul standaard + 80ul 1 X TE
3 15ul 2.0ng / ul standaard + 85ul 1 X TE
4 10ul 2.0ng / ul standaard + 90ul 1 X TE
5 5ul 2.0ng / ul standaard + 95ul 1 X TE
6 3ul 2.0ng / ul standaard + 97ul 1 X TE
7 1ul 2.0ng / ul standaard + 99ul 1 X TE
8 0.5ul 2.0ng / ul standaard + 99.5ul 1 X TE
9 1ul 0,2 ng/ul standaard + 99ul 1 X TE
10 0.5ul 0.2ng / ul standaard + 99.5ul 1 X TE
11 100ul 1 X TE
Monster instellen
De hoogste concentratie die de flurometer kunt lezen is 0.2ug. Als het DNA is bekend om zijn hoger dan 0.2ug, voert u de nodige verdunningen te krijgen een DNA-concentratie van minder dan 0.2ug. Altijd uitvoeren ten minste een 1:20 verdunning van de DNA-monsters . Als u werkt met sterk geconcentreerde DNA (500ng/ul), zou een 1:200 verdunning fijn moeten zijn.
1. toevoegen 95ul voor 1 X TE buffer aan alle buizen van het monster (met inbegrip van het duplicaat/drievoud buis).
2. toevoegen 5ul van de verdunde DNA-monster, tot de 95ul 1 X TE buizen. Afzien Pipetteer buis na elk aliquot van DNA (figuur 1). Moet er een totaal volume van 100ul op dit punt.
3. uitschakelen in het licht van de moleculaire kap
4. pak de picogreen
6. Voeg met behulp van de 1000ul reagens pipet 8520ul 1 x TE buffer in elke buis Picogreen
7. kort vortex alle Picogreen buizen te mengen
8. centrifugeren, indien mogelijk, de picogreen-buizen
9. hoeveelheid 100ul van Picogreen (met een nieuwe pipette uiteinde voor elk aliquot) alle 161 buizen (figuur 2) beginnen met de laagste norm (100ul 1 X TE). De buizen van het GLB na elk aliquot picogreen.
a. de Picogreen buis dient voldoende Picogreen voor 42 monsters; leeg de buis uit.
10. pak een ander Picogreen buis en herhaalt u stap 9 totdat alle de DNA-monsters, met inbegrip van de normen hebben ontvangen 100ul van picogreen