Stap 17: Geavanceerde DIYBio genetische analyse: volgnummer van uitlijning en analyse
Zo hebt u uw PCR product en nu wilt u zien wat het zegt?
Als een DIYbiologist het wellicht moeilijk te vinden een kern DNA sequencing faciliteit, maar het loont rondneuzen op je lokale universiteit of zoeken op het internet voor "dna sequencing services". Het kan moeilijk te vinden een plek die bereid is te nemen van DNA van onafhankelijke mensen, vooral degenen die het zuiveren door middel van "homebrew" methoden, dus dit waar het partnering is omhoog met een lokale DIYBio lab is waarschijnlijk het beste zijn. In beide gevallen moet u sturen de sequencing-faciliteit uw DNA samen met de inleidingen (of primer sequenties) u wilt hen opeenvolging met, kunt u uw PCR inleidingen te gebruiken of extra "geneste" inleidingen binnen uw PCR- amplicon in reeks met ontwerpen (aanbevolen).
Zodra u bent kundig voor vondst een sequencing faciliteit en u ontvangt uw rangschikkend resultaten die u zult moeten analyseren. Ik heb nog om te vinden van de perfecte vrije sequentie alignering en software voor videobewerking. Voor de meeste kunt u bewerken of uitlijnen rangschikkend resultaten (chromatogrammen), niet beide, en het is een echte pijn te bewerken elke chromatografische apart dan uitlijnen van de basecalls (tekstformaat). Dit is waar de commerciële producten hebben de definitieve overhand.
De bovenstaande foto's zijn de HBB chromatogrammen die ik gegenereerd en de volgorde van de HBB-referentie in BioEdit, die zorgt voor veel van de dezelfde functies als de commerciële producten echter alleen voorziet paarsgewijze uitlijning. Unipro de UGENE ook ziet er goed uit, maar ik heb niet het gebruikte. Afwisselend, kon u bewerken en converteren van alle de chromatogrammen naar tekstbestanden en uitlijnen met behulp van een programma zoals Clustal of een willekeurig aantal van de programma's in deze lijst.
Zodra u uw chromatogrammen die u wilt bewerken van de sequenties laadt moet ervoor zorgen het geautomatiseerd programma de juiste basis oproepen gemaakt door te klikken naar de bewerkbare volgorde (tweede foto). Zodra u alle sequenties die bewerkt hebt kunt u brengen in hun gratis reeks en eventuele discrepanties of verifiëren heterozygoot nucleotiden. U kunt ook de volgorde van de verwijzing voorbereiden door weer te geven (derde en vierde foto) beschikt, zodat u kunt de polymorfismen (variaties, vijfde foto) in de volgorde zien en, na aanpassing, zien als uw monster polymorfismen heeft.
Om het downloaden van de referentie-reeks vinden (of het ontwerpen van inleidingen tegen voor de vorige stappen of aanpassing in deze stap) het gen die u in de database van de Gene op NCBI zoekt Op te klikken in het gen neem scroll naar beneden naar de sectie "NCBI referentie sequenties (RefSeq)" en selecteer de koppeling 'GenBank' onder de 'Genomic' RefSeqGene. Dit brengt u naar de GenBank volgnummer (zesde foto) waar u de referentie-reeks kunt downloaden door te klikken op het dropdown menu naast te 'Sturen' (zevende afbeelding).
