Stap 2: Het protocol
Dit papier heeft een goed overzicht van de verschillende methoden voor weefsel decellularization:
Een overzicht van weefsel en hele orgel decellularization processen
We hebben eigenlijk twee verschillende varianten van het varken hart protocol: de oorspronkelijk gepubliceerd door Wainwright et al. in hun paper 2010en het gewijzigde protocol van de video in de Journal of gevisualiseerd Experiments 2012, door de zelfde groep. Beide versies beginnen met bevriezing op-80C en vervolgens het ontdooien van het hart, om te helpen doorbreken op cellen.
Wainwright et al. papier:
- Perfuse 3L Type 1 reagens rang water gedurende 15 minuten op 1 L/min, dan 2xPBS (fosfaatgebufferde zoutoplossing) gedurende 15 minuten op 1 L/min
- Perfuse van de Trypsine van 0,02% / 0,05% ethyleendiamminetetra zuur / 0,05% NaN3 bij 37C gedurende 2 uur op 1 L/min
- Perfuse Type 1 water gedurende 5 minuten, dan 2xPBS voor 15min
- 3% perfuse Triton X-100 / 0,05% ethyleendiamminetetra zuur / 0,05% NaN3 voor 2 h bij 1.3 L/min
- Perfuse Type 1 water gedurende 5 minuten, dan 2xPBS voor 15min
- 4% deoxycholic zure oplossing voor 2h bij 1.3 L/min perfuse
- Perfuse Type 1 water gedurende 5 minuten, dan 2xPBS voor 15min
- Perfuse van 0,1% Perazijnzuur zuur / 4% ethanol voor 1h 1,7 L/min
- Perfuse met PBS tweemaal, en Type 1 water drie keer, elke 15min 1,7 L/min
Als je alles bij elkaar optelt, duurt dit protocol ongeveer 10 uur van start tot finish voor alle stappen van de perfusie. De gewijzigde versie van de video Jove gaat door een groot deel dezelfde stappen, verlenging van de trypsine en deoxycholic zuur behandeling tot 3h en de wasmiddel behandeling naar 2.5 h, voor een totale tijd van ongeveer 13 uur perfusie! Ze oprit ook de snelheid van de perfusie van 400ml/min voor het eerste water perfusie, aan 2.2 L/min voor de deoxycholic en de daaropvolgende stappen.
In ons geval, hadden we alleen ongeveer 10 uur totale om dit te bereiken, en we geliquideerd uitgaven een goede hoeveelheid van die tijd het testen van de pomp, tot vaststelling van lekken in de verbindingen ontleden beneden het hart enz. Dus we geliquideerd de duur om te passen in de resterende tijd aan te passen.
Aan de andere kant, aangezien we maakten een pronkstuk in plaats van een spook hart dat met succes kon worden reseeded met stamcellen, we wisten dat we gemakkelijk kunnen bedriegen op enkele van de ingrediënten. In het bijzonder, hebben we gewoon kraan water gebruikt in plaats van gallons en gallons dure "Type 1" reagens rang water. Ook gebruikte wij enkel gewone keuken zout in leidingwater in plaats van fosfaatgebufferde zoutoplossing. We gebruikten OxyClean (Natriumpercarbonaat) in plaats van azijnzuur zuur, en 151-proof Everclear in plaats van reagens rang ethanol voor de definitieve ontsmetting stap. We wilden ook gebruik van SDS in plaats van Triton X-100 als het wasmiddel, want SDS neigt om witter van het weefsel beter (ten koste van zijnde somewha strenger op de extracellulaire matrix). We hadden niet genoeg SDS, zodat we geliquideerd gaan met 2% SDS / 1% Triton X-100. Ook vertrokken we uit de natriumazide (NaN3), die is er voor de remming van de groei van bacteriën, maar is ook zeer giftig - iets wij liever niet met in een DIY instelling knoeien zouden.
Oh, en wij niet beschikken over een hoog-volume peristaltische pomp, maar we hadden een Bio-Rad Buffer circulatie pomp (Zie http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1702929C.pdf) die theoretisch kan maximaal 1,5 L/min. Niet bestemd om te leveren het soort druk die we nodig hebben, maar meh - laten we gewoon zien wat er gebeurt...
Dus is hier wat we geliquideerd met op het einde:
- Perfuse 3L leidingwater voor 15min, dan hoge saline (50g-keuken zout in 3L leidingwater) gedurende 15 minuten
- Perfuse van de Trypsine van 0,02% / 0,05% ethyleendiamminetetra zuur bij 37C gedurende 1,5 h
- Perfuse leidingwater voor 10min, dan hoge saline gedurende 10 minuten
- Perfuse 2% SDS / 1% Triton X-100 voor 50 min
- Perfuse leidingwater voor 5 minuten, dan hoog zout voor 5min
- Perfuse 2,5% desoxycholzuur (25g in 1L) voor 20min
- Perfuse leidingwater voor 5 minuten, dan hoog zout voor 5min
- Perfuse van 0,5% OxyClean / 4% ethanol voor 1h 1,7 L/min
- Saline (25g in 3L), dan leidingwater voor 5min perfuse
- Laat afvoer, dan spul in Ikea jar met 151 bewijs Everclear!
